Значение уровня тимидилатсинтетазы для прогноза и эффекта химиотерапии при колоректальном раке

В химиотерапию колоректального рака в последние годы вошел ряд новых активных препаратов, таких как оксалиплатин, томудекс, иринотекан, капецитабин и др. В настоящее время активно изучаются новые биохимические опухолевые маркеры, способствующие выбору рациональной химиотерапии.
   Тимидилатсинтетаза (ТС) является одним из ключевых ферментов, контролирующих репликацию ДНК [1]. Этот фермент катализирует превращение дезоксиуридина монофосфата в дезокситимидин монофосфат, который является единственным источником синтеза тимидина, начальным предшественником для репликации ДНК. ТС является мишенью для ингибирования некоторых противоопухолевых препаратов, в частности 5-ФУ и томудекса (см. рисунок).
   5-ФУ является непрямым ингибитором ТС, метаболиты которого необратимо с ним связываются, блокируя деление клеток. Активные метаболиты 5-ФУ: 5-фтордезоксиуридин монофосфат (FdUMP), 5-фторуридин трифосфат (FUTP) и 5-фтордезоксиуридин трифосфат (FdUTP) ответственны за противоопухолевый эффект препарата [2]. FdUMP связывается с ТС, препятствуя синтезу тимидина трифосфата. FdUTP инкорпорируется в ДНК, приводя к ее разрывам. FUTP инкорпорируется в РНК, вызывая нарушения ее стабильности и функции. При повреждении ДНК и РНК одним из основных механизмов апоптоза является стабилизация р53 [3].
   Томудекс – прямой и специфический ингибитор ТС, проникает в опухолевую клетку с помощью восстановленного переносчика фолатов – фолиполиглутаматсинтетазы, инициирующей реакцию полиглутамации томудекса, который более чем в 70 раз сильнее блокирует ТС, чем первичное соединение [4].
   Капецитабин также является ингибитором ТС. В результате двух этапов его биохимического превращения он избирательно накапливается в опухоли под влиянием тимидинфосфорилазы, образуя 5-ФУ, взаимодействующий с ТС.

ТС как мишень действия противоопухолевых препаратов.
FdUMP – 5-фтордезоксиуридин монофосфат, FdUTP – 5-фтордезоксиуридин трифосфат, FUTP – 5-фторуридин трифосфат, 5-ФУ – 5-фторурацил, ДПД – дегидропиримидин дегидрогеназа, ТС – тимидилатсинтетаза.

Методика исследования
   Уровень ТС в опухоли определяли с помощью иммуногистохимии, используя коммерческие моноклональные антитела к ТС клон TS-106, Chemicon, которые являются “золотым стандартом” среди антител к ТС. Поскольку невысокий уровень ТС может экспрессироваться и в нормальных тканях, важным является выбор адекватных критериев оценки окрашивания антителами к ТС. В большинстве работ, посвященных исследованию уровня ТС, при колоректальном раке используются следующие критерии оценки [5, 6]:
   0 – отсутствие окрашивания или окрашивание с любой интенсивностью менее 20% опухолевых клеток;
   1+ – слабое окрашивание цитоплазмы более 25% опухолевых клеток;
   2+ – среднее окрашивание цитоплазмы более 25% опухолевых клеток;
   3+ – сильное окрашивание цитоплазмы более 25% опухолевых клеток.
   Опухоли, оцениваемые как 2+ и 3+, являются положительными по экспрессии ТС.
   Для определения уровня транскрипции ТС все чаще используют обратную транскриптазную ПЦР в реальном времени, которая позволяет количественно определить уровень мРНК в цитозоле клеток. Этот метод позволяет наиболее точно оценить уровень мРНК ТС на небольшом количестве материала (например, при пункции или биопсии). Однако требуется тщательный контроль взятого материала: образец пригоден для исследования, если содержит более 80% опухолевых клеток при цитологическом исследовании [7, 8]. К недостаткам этого метода относятся также необходимость дорогостоящего оборудования и высокая стоимость исследования. Недавно был описан метод выделения опухолевых клеток из срезов с парафиновых блоков путем микродиссекции с последующим проведением количественной ПЦР, при этом точность определения уровня ТС составила более 80% [9].
   Другим используемым методом является определение количества специфических повторов в промотере гена ТС [10, 11]. Увеличение синтеза ТС часто связано с полиморфизмом энхансер-региона промотера (который определяет активность трансляции мРНК с гена). Промотер ТС состоит из 28 пар оснований, обычно присутствующих как двойной тандем повторов (TSER*2) или тройной тандем повторов (TSER*3). Исследования in vitro показали, что 3 копии повторов усиливают синтез мРНК ТС более чем в 2,6 раза. Показано также, что TSER*3/TSER*3 опухоли резистентны к 5-ФУ. Меньшей резистентностью обладают гетерозиготы TSER*3/TSER*2, тогда как гомозиготы TSER*2/TSER*2 хорошо поддаются лечению [10].
   Какой из методов определения ТС в опухоли является лучшим? Отдельные исследования показали, что измерение уровня мРНК на свежезамороженном материале сильно коррелирует с уровнем белка, измеренным с помощью Вестерн-блоттинга, или с функциональной активностью ТС (связывание fdUMP) [12, 13]. Также отдельные исследования сообщают о соответствии уровня мРНК ТС, измеренной с помощью количественной ПЦР, с уровнем белка, определенным с помощью иммуногистохимии (ИГХ) на парафиновых блоках. Метод ИГХ обладает неоспоримым преимуществом – возможностью проведения исследования на парафиновых блоках, однако он требует дальнейшей стандартизации (используемые антитела, критерии оценки и т.д.).   

Экспрессия ТС при колоректальном раке
   Повышенная экспрессия ТС в ткани первичной опухоли колоректального рака обнаружена в 44% случаев. При этом она коррелировала с накоплением общего р53 (r=0,48; p=0,001). Экспрессия ТС была выше у больных со стадией заболевания C (62%) по сравнению с больными со стадией B (32%).
   Уровень ТС играет важную прогностическую роль не только для больных, получающих химиотерапию на основе 5-ФУ и томудекса, но и для больных после хирургического лечения. Это может объясняться тем, что уровень ТС опосредованно связан с пролиферативной активностью клетки. Высокая пролиферативная активность клеток часто непосредственно определяет прогноз заболевания. Длительность безрецидивного периода после радикального удаления опухоли была больше у больных с низким уровнем ТС в опухоли [14, 15]. По нашим данным, гиперэкспрессия ТС связана с уменьшением безрецидивной и общей выживаемости больных колоректальным раком стадий В и С, не получавших адъювантного лечения (см. таблицу). При гиперэкспрессии ТС медиана безрецидивной выживаемости больных составила 26 мес, в то время как при низкой экспрессии медиана достигнута не была (p=0,02). Общая выживаемость больных с гиперэкспрессией ТС составила всего 59 мес, а при низкой – 178 мес (p=0,03).
   Показано, что уровень ТС выше в колоректальных опухолях типа аденокарциномы с большим выделением слизи [16].
   Проведены исследования корреляции уровня ТС первичной опухоли и метастазов, для прогнозирования эффективности химиотерапии после удаления первичной опухоли. Однако существенной корреляции между уровнем ТС первичной опухоли и метастазов не получено [15, 17, 18]. Замечено, что уровень мРНК ТС оказался выше в метастазах в лимфоузлы и легкие, чем в соответствующей первичной опухоли, тогда как метастазы в печень имели более низкую экспрессию ТС. Эти результаты показывают, что экспрессия в первичной опухоли ТС не может влиять в достаточной степени на лечебное решение при использовании ингибиторов ТС. Не все исследователи согласны с таким утверждением. Недавно было показано, что по полуколичественному определению мРНК ТС и дегидропиримидин дегидрогеназы (ДПД) в первичной опухоли можно предсказать эффективность химиотерапии УФТ при метастазах в печени. По нашим данным, в 70% случаев колоректального рака наблюдается соответствие экспрессии в первичной опухоли и метастазах в лимфоузлы и печень, определенных иммуногистохимически.
   Эффективность химиотерапии и уровень ТС. Большинство исследований показывает, что колоректальный рак с высоким уровнем содержания ТС плохо поддается лечению инфузиями 5-ФУ, опухоли же с низким ее содержанием – хорошо [19]. Частота встречаемости таких высокочувствительных опухолей с низким уровнем ТС составляет от 15 до 20%. Считается, что эффективность 5-ФУ у больных с низким уровнем ТС в 3 раза выше по сравнению с ТС-положительными больными.
   Однако не все исследования подтверждают корреляцию между высоким уровнем ТС и резистентностью к 5-ФУ. Имеются сообщения о том, что экспрессия ТС не влияет на успех химиотерапии [10, 17, 10–22]. Есть парадоксальное сообщение, что высокий уровень ТС отрицательно сказывается на эффективности лечения, в то время как очень высокий – дает хорошие результаты [23].
   Подобные разногласия могут быть связаны с малым числом наблюдений в исследованиях и статистической недостоверностью, но заставляют задуматься и о том, что не только уровень ТС влияет на успех химиотерапии. Ведется поиск и других факторов резистентности. Другой причиной вариабельности может быть режим введения 5-ФУ. Краткосрочное (струйное) введение 5-ФУ с или без лейковорина может в большей степени повреждать мРНК, а не ДНК, как при длительных инфузиях [24]. Возможно, эффективность краткосрочных введений 5-ФУ менее зависима от уровня ТС в опухолевых клетках.
   Маркером чувствительности или резистентности к 5-ФУ является также ДПД, которая инактивирует 5-ФУ [3]. Делались попытки определить корреляцию между уровнем ТС и ДПД в ткани КРР, но таковой обнаружено не было [25]. Одновременно достоверно показано, что высокий уровень ДПД снижает эффективность терапии 5-ФУ. Установлено, что больные ТС-отрицательные и ДПД-отрицательные наиболее часто отвечают на терапию 5-ФУ.
   При использовании прямого ингибитора ТС томудекса показано, что больные с низким уровнем ТС имели высокую эффективность лечения томудексом и значительное увеличение выживаемости (при низком уровне мРНК ТС – 21,7 мес, при высоком уровнем – 5,7 мес). При этом уровень ДПД не влиял на эффективность терапии томудексом [26].
   Исследуется роль р53 как одного из звеньев в цепи реакций, приводящих в конечном итоге к гибели клетки. Как известно, существует дикий и мутантный тип р53. Если клетка содержит дикий тип, то в ней в ответ на повреждение ДНК или образование мутаций запускается апоптоз. Если же в клетке содержится мутантный р53, то апоптоза поврежденной клетки не происходит. Это является как одним из факторов образования опухоли, так и фактором развития резистентности к химиотерапии, так как при наличии мутантного р53 в клетке не происходит апоптоз в ответ на воздействие 5-ФУ [27]. Имеются исследования, направленные на установление связи между уровнем ТС и экспрессией р53 [16, 28]. Показано, что мутантный тип р53 активирует синтез ТС.
   Интересные сведения получены при изучении роли тимидина как опухолевого протектора против воздействия томудекса [29]. Показано, что высокий уровень тимидина нивелирует эффект томудекса, т.е. опухоль использует тимидин для своей защиты. Тимидин с помощью тимидинкиназы превращается в dTMP, что делает бесполезной ингибицию ТС.
   Активно изучаются подходы к снижению уровня ТС в опухолевых клетках. Использование оксалиплатина в комбинации с 5-ФУ позволяет преодолеть химиорезистентность, вызванную ТС. Показано, что оксалиплатин может снижать экспрессию ТС, чем объясняется эффективность режима оксалиплатин+5-ФУ+лейковорин в случаях, прежде неэффективно леченных 5-ФУ+лейковорин [30]. В наших исследованиях также доказана высокая эффективность этого режима при ТС-положительном метастатическом раке [31].
   Другой путь снижения ТС связан с использованием бутирата – регулятора синтеза ДНК. Бутират выделен из клеток слизистой оболочки ободочной кишки. Доказано, что его комбинация с 5-ФУ дает снижение активности ТС на 75%, при этом активируется апоптоз опухолевых клеток и замедляется их пролиферация. Бутират способен также потенцировать эффект лечения томудексом [32].
   Усиление эффекта томудекса при колоректальном раке может быть достигнуто при дополнительном влиянии на трансляцию ТС [8]. Для воздействия на процесс трансляции мРНК ТС предложено использовать олигорибонуклеотид – HYBO432. Его действие нацелено на регуляторный элемент 5’ конца РНК (нуклеотиды 80–109) [33]. Препарат ISIS 13783 является антисмысловым олигонуклеотидом ТС, который снижает уровень экспрессии ТС на 70%.   

Заключение
   ТС является одним из наиболее значимых биохимических и молекулярно-биологических маркеров при колоректальном раке. Его определение в ткани опухоли помогает определить риск метастазирования после удаления первичной опухоли, выбрать наиболее эффективную терапию. Ингибиторы ТС занимают значительное место в химиотерапии колоректального рака. Сегодня активно разрабатываются подходы к снижению уровня белка в опухоли, что позволит более эффективно лечить больных, резистентных к традиционной терапии 5-ФУ+лейковорин. Использование дополнительных исследований ТС, ДПД у больных колоректальным раком позволит значительно усилить лечебную эффективность у каждого индивидуального больного.
   Работа выполнена при поддержке федеральной программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского значения” в рамках проекта “Разработка новых методов лекарственной терапии больных злокачественными заболеваниями на основе анализа ангиогенных свойств опухоли”.