Чтобы понять роль фотодинамической терапии (ФДТ) в лечении злокачественных новообразований, необходимо вначале представлять себе стандартные на сегодня подходы к этой проблеме. Удобно подразделять все варианты лечения на местнорегиональные (в ходе которых оказывается воздействие на опухоль в области ее первичного возникновения) и системные (при которых проводится терапия диссеминированных форм рака).

Основные виды местнорегиональной терапии - это хирургическое лечение и радиотерапия. Обычно они направлены на уничтожение первичной опухоли и метастазов в регионарных лимфатических узлах. У большого числа больных раком эти виды лечения достаточны сами по себе. Системное лечение, обычно подразумевающее химио- или какую-либо форму иммунотерапии, применяется при удаленных макро- и микрометастазах. Основные цели такого лечения - повышение выживаемости и улучшение результатов хирургических вмешательств с одновременным повышением степени контроля за местными проявлениями опухоли. ФДТ - исключительно местнорегиональная терапия, нацеленная на местные проявления заболевания.

Для полноты понимания причин применения того или иного лечения необходимо также представлять стадийность развития и биологию рака, которые могут серьезно отличаться при различных формах заболевания, как, например, при раке молочной железы и раке легких. Систематизирование пациентов по стадиям заболевания позволяет выделить прогностические группы. При этом также отражается и биология конкретных форм рака. Знание стадийности и биологии рака позволяет онкологу выбрать необходимые методы лечения, а исследователю оценить может ли новый метод повлиять на ход болезни.

За несколько прошедших десятилетий терапия большинства форм рака претерпела существенные изменения. Одним из относительно недавних концептуальных нововведений стало понимание необходимости сочетанной местной и системной терапии в силу их взаимодополнения (этот вывод базировался на знании биологии некоторых форм рака). Для многих солидных образований местное лечение по прежнему остается основой лечения. Тем не менее, сознание того, что нераспознанные микрометастазы представляют основную клиническую проблему, сокращая выживаемость, привело к разработке системной терапии как адъювантной по отношению к местной. В последствии, химиотерапия была изучена в рандомизированных клинических испытаниях и вошла в число стандартных клинических подходов к лечению (Oilman et al., 1990; Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group, 1992; Jeremic et al., 1996).

Оценивая роль ФДТ в онкологии, следует начать со стадийности и биологии рака, чтобы затем понять возможности этого нового метода терапии в арсенале современных лечебных средств. Чтобы применить ФДТ при конкретной форме рака, необходимы больший или сходный процент излечения, меньшая смертность и/или снижение экономических расходов по сравнению со стандартными методами лечения.
     Можно с уверенностью сказать, что ФДТ не будет применяться при всех формах рака. В некоторых клинических случаях поверхностного воздействия ФДТ вполне достаточно, в других - нет. Скорее всего, ФДТ будет применяться там, где имеющиеся на сегодня методы лечения не дают удовлетворительных результатов или ведут к высокой смертности.

Уникальные свойства ФДТ позволят однозначно определить место этого метода лечения в терапии рака. ФДТ в нынешнем виде представляет местнорегиональный вариант лечения, то есть воздействует на первичные и, вероятно, на местно-распространенные опухоли. Таким образом, ФДТ будет играть ведущую роль в избранных областях подобно хирургии и радиотерапии сегодня. Целью применения такого лечения будет улучшение контроля над местными симптомами опухоли и снижение смертности по сравнению с хирургическими вмешательствами и радиотерапией. Каковы же тогда преимущества и недостатки ФДТ применительно к этим методам лечения?

ФДТ оказывает поверхностный эффект. При условии равномерного распределения фотосенсибилизатора и кислорода в ткани-мишени (в чем нельзя быть уверенным) объем поражения этой ткани при ФДТ зависит от глубины проникновения света. Для большинства комбинаций фотосенсибилизаторов эта величина лежит в диапазоне от нескольких миллиметров до одного сантиметра (Star, 1997). Такая поверхностность воздействия может в зависимости от клинической ситуации рассматриваться и как преимущество, и как недостаток по сравнению с хирургическим вмешательством и радиотерапией. Малая глубина проникновения будет ограничивать применение ФДТ. В то же время, с помощью ФДТ можно эффективно лечить такие поверхностные заболевания, как рак in situ или дисплазия слизистой. Аналогичным образом можно лечить и микроскопические остаточные проявления опухоли после резекции. Создается впечатление, что применение ФДТ с наружным облучением опухоли светом не будет эффективно при больших местно-распространенных опухолях. В последнем случае преимущества ФДТ перед хирургическим вмешательством и радиотерапией будут незначительны.

Поверхностность эффектов ФДТ может расцениваться как преимущество при сравнении с хирургическим вмешательством и радиотерапией с точки зрения тяжести вмешательства. Во многих случаях полное оперативное удаление злокачественной опухоли ведет к существенной смертности. Несомненно, что ФДТ могла бы использоваться вместо хирургического вмешательства или, как адъювантная терапия, позволяющая уменьшить объем последующей операции (или понизить процент смертельных исходов после вмешательства). Хорошей иллюстрацией этой точки зрения является лечение предракового заболевания пищевода, называемого "Барреттовским пищеводом" ("Barrett's oesophagus"). При этой патологии развивается выраженная дисплазия пищевода, в дальнейшем перерождающаяся в аденокарциному (Spechler, 1994; Palley et al., 1989). Метод выбора - эозофагоэктомия, приводящая к высокой смертности. ФДТ потенциально может позволить полностью излечивать это заболевание, сделав ненужной обширную хирургическую операцию. Проводятся активные исследования этого вопроса (Barr et al., 1996; Overholt и Panjehpour, 1996).

Поверхностность воздействия ФДТ также выигрывает по сравнению с радиотерапией, если принять во внимание побочные эффекты. При облучении обширных поверхностей, как, например, плевра или брюшина, ФДТ оказывается предпочтительнее, в силу меньшего повреждения здоровых подлежащих тканей. В качестве примера можно взять заболевания плевральной полости. При наружной радиотерапии поле облучения захватывает всю половину грудной клетки, а доза радиации ограничена вероятным необратимым повреждением тканей легкого, которые разрушаются даже при обычных лечебных дозировках (Herscher et al., 1998; Mattson et al., 1992). Теоретически ФДТ идеальна для лечения заболеваний плевры, поскольку цитотоксический эффект будет проявляться только в самой плевре и нескольких миллиметрах подлежащих тканей легкого или грудной стенки (Takita et al., 1994; Pass и Donington, 1995).

Конечно же, имеются и недостатки в поверхностности цитотоксических эффектов ФДТ. При многих массивных, инвазивных или глубоколежащих опухолях поверхностное облучение светом будет недостаточным для воздействия на всю толщу новообразования. В этом случае использование ФДТ в качестве монотерапии будет недостаточным. В качестве варианта лечения следует рассматривать комбинацию ФДТ и хирургического вмешательства или интерстициальную доставку света. Во многих таких случаях следует признать большую эффективность хирургического вмешательства и/или радиотерапии.

Другим вариантом патологии, при котором ФДТ не будет оптимальным подходом, является лечение метастазов в регионарных лимфатических узлах. Хирурги и радиотерапевты-онкологи уже на протяжении многих лет признают проблему наличия микрометастазов в регионарных лимфатических узлах при солидных злокачественных новообразованиях. При многих формах рака, особенно при локализации в области головы и шеи, стандартными стали удаление регионарных лимфатических узлов и/или радиотерапия. Ограниченная глубина проникновения света при ФДТ может стать препятствием при использовании этого метода лечения при резидуальных поражениях лимфоузлов. Решением проблемы могут стать комбинированное использование ФДТ и других методов лечения, а также поиск новых фотосенсибилизаторов, вызывающих биологические эффекты на большей глубине.

Наконец, в литературе имеются упоминания избирательности накопления фотосенсибилизатора в опухолевых тканях по сравнению с нормальными (Gomer и Dogherty, 1979; Jori, 1996; Young et al., 1996; Dougherty et al., 1998). Потенциальной специфичности ФДТ в отношении опухоли (и меньшего повреждения нормальных тканей) можно достичь за счет как накопления/задержки фотосенсибилизатора, так и ограничения области новообразования, облучаемой светом. Этот вариант усиления терапевтического эффекта дает ФДТ серьезные преимущества перед другими методами лечения. Тем не менее, пока что остается не ясно будет ли (а если будет, то в какой степени) эта специфичность воздействия использована в клинической практике. Терапевтический потенциал ФДТ можно будет использовать гораздо полнее при повышении специфичности фотосенсибилизаторов и при улучшении методик доставки света к поверхностям со сложной геометрией.
     ФДТ как метод лечения находится на стадии становления. На сегодня имеется ряд показаний к ее применению в клинике (Dougherty et al.,1998). Тем не менее, в большей степени область применения ФДТ будет определена в наступившем десятилетии. Как же ФДТ интегрируется в имеющийся арсенал методов лечения?

В качестве первого шага необходимо выявить те клинические ситуации, при которых обсужденные выше уникальные свойства ФДТ будут крайне полезны с точки зрения терапии, и при которых имеющиеся на сегодня методы лечения малодейственны или чреваты неприемлемыми побочными эффектами. Следующим шагом станет систематическая оценка ФДТ в ходе хорошо спланированных клинических испытаний. На стадии I будет необходимым определить побочные эффекты и максимальные дозировки для каждой конкретной области. На стадии II следует оценить эффективность терапии, используя четкие выборки пациентов. Наконец, если это будет оправдано большим процентом успешной терапии или снижением смертности, на стадии III потребуется сравнить ФДТ со стандартными методами лечения.

Для проведения этих испытаний крайне необходимо четко определить параметры для дозировки фотосенсибилизатора и света. Крайне трудно оценить эффективность и побочные эффекты терапии без четкой количественной оценки проводимого лечения. Как можно определить зависимости доза-эффект или доза-токсичность для терапии, параметры которой точно не известны? Одной из причин принятия радиотерапии в качестве лечебного метода стала возможность точной дозировки лучевой нагрузки на ткани и ее корреляции как с реакцией опухоли, так и с побочными эффектами. Для ФДТ эта проблема представляется более сложной, поскольку включает как дозировку света, так и доставку препарата. Более того, на биологический эффект дозы фотосенсибилизатора и света влияют многие параметры: доставка препарата, объемная геометрия тканей, фотоинактивация сенсибилизатора, оксигенация тканей и гетерогенность их оптических свойств. Именно из-за этих сложностей и следует предпринимать попытки измерить дозы света и фотосенсибилизатора в тканях. К сожалению, на текущий момент проводимая на территории США фотодинамическая терапия не предусматривает четкого дозирования сета и сенсибилизатора. Одобренные FDA (Food and Drug Administration) методики лечения обструктивного рака пищевода и ранних стадий рака легких базируются на подходах к дозировке, больше подобающих поваренной книге. В то же время, остается не до конца изученной вариабельность накопления фотосенсибилизатора и дозы света в поверхностных тканях, что может оказывать существенное влияние на успех или неудачу при данном методе лечения. Часто оказывается проблематичной оценка упоминаемых в отдельных исследованиях доз света, примененных для облучения конкретных тканей. Многие группы исследователей приняли во внимание эту проблему и сделали серьезные успехи в дозиметрии света и фотосенсибилизаторов (Chen et al., 1997; Star, 1997; Farrell et al., 1998). Невозможно переоценить значимость дальнейших исследований в этой области и выработки приемлемой системы дозировки света.

В клинической онкологии имеется ряд областей, где ФДТ могла бы оказаться эффективной, что можно предсказать, исходя из биологии рака, а также используя другие критерии, обсужденные ранее. Кроме того, возможно совместное использование ФДТ с другими методами лечения.
     Диспластические предопухолевые состояния или неинвазивные формы рака нередко возникают на слизистых дыхательного, пищеварительного и мочевыделительного трактов. Хотя биологические аспекты предраковых состояний ясны не до конца, в общем виде это поверхностно расположенные образования с высоким риском перерождения в инвазивную форму рака. В качестве примеров можно привести дисплазию слизистой полости рта, эзофагит Барретта (Barren's oesophagus) с высокой степенью дисплазии, дисплазия или рак in situ легких и рак in situ мочевого пузыря. Для разработки более эффективных вариантов лечения при данных заболеваниях имеется несколько причин Во-первых, излечение на стадии предопухолевого состояния, то есть неинвазивного процесса, позволяет избежать метастазирования, остающегося ведущей причиной смертности у больных раком. Во-вторых, наиболее вероятно, что лечение предопухолевого состояния обойдется дешевле как с точки зрения финансовых затрат, так и с точки зрения человеческих жизней, чем терапия солидного инвазивного новообразования. В-третьих, имеющиеся на сегодня варианты терапии многих из этих заболеваний не дают удовлетворительного результата или связаны с тяжелыми побочными эффектами.

Хирургические вмешательства при перечисленных состояниях требуют общей анестезии и сопровождаются серьезными осложнениями, включая функциональные расстройства и уродства. Иногда при раке in situ можно использовать лучевую терапию, но острые и хронические осложнения не позволяют сделать этот вариант лечения рутинным. Обычно радиотерапию можно применить только один раз, а рецидивы заболевания в других местах слизистой являются правилом. Химиотерапия, особенно ретиноидами, оказалась эффективной в предотвращении опухолевой трансформации у больных с дисплазиями в области головы и шеи (Geyer et al., 1998). В то же время, ретиноиды применяются длительно, что нередко ведет к побочным эффектам.
     ФДТ кажется потенциально привлекательным методом лечения при дисплазии слизистых и раке in situ. Эти заболевания возникают в слизистой и имеют большую площадь поражения. Помимо участков с доказанной дисплазией или раком, измененные клетки могут встречаться и в других удаленных от первичного заболевания областях слизистой. Теоретическим преимуществом ФДТ является возможность широкого поверхностного воздействия. Более того, теоретически ФДТ может применяться повторно в отличие от хирургического вмешательства или лучевой терапии. Имеются сообщения об успешном лечении эзофагита Барретта (Barren's eosophagus), дисплазии слизистой полости рта и рака in situ мочевого пузыря. Клинические испытания продолжаются (Grant et al., 1993; Barr et al., 1996; Overholt и Panjehpour, 1996; Nseyo et al., 1998).

Опухоли, возникающие или метастазирующие в серозные оболочки, включают карциноматоз брюшины, злокачественную мезотелиому и другие злокачественные заболевания плевры. Эта разнородная группа заболеваний с различной биологией развития и подходом к лечению. Чаще всего такие формы первичного или метастатического рака инкурабельны в силу обширности поражения. Крупные образования можно удалить хирургически, но удаление микроскопических очагов маловероятно. Местные рецидивы, или скорее персистенция, наиболее частая причина неудач при попытках хирургического вмешательства при карциноматозе брюшины, мезотелиоме или метастатических поражениях плевры. Выбор адекватной схемы лучевой терапии крайне затруднен из-за невысокой лучевой толерантности здоровых тканей, делающей невозможным применение терапевтической дозы облучения.

Теоретически, ФДТ - идеальная терапия при поверхностных злокачественных поражениях серозных оболочек. При лечении микроскопических поражений возможно совместное применение ФДТ и хирургических методов Ограниченная глубина цитотоксических эффектов предотвращает тяжелое поражение подлежащих органов.
     Рак яичников - достаточно иллюстративный пример потенциальных возможностей ФДТ в лечении поверхностных злокачественных новообразований. У больных с далеко зашедшим раком яичников обычно наблюдается диссеминированное поражение брюшины. Метастазы за пределами брюшной полости, как правило, появляются на очень поздних стадиях. Вслед за ремиссией, индуцированной химиопрепаратами, следует предсказуемый рецидив заболевания. Стандартное лечение рака яичников - хирургическое вмешательство с последующей химиотерапией. Концептуально это идеальное заболевание для оценки ФДТ, поскольку поражение часто ограничивается поверхностью брюшины. Результаты фазы I клинических испытаний показали, что ФДТ легко переносится и может вести к длительной ремиссии (Delaney et al., 1993; Sindelar et al., 1995).

Тем не менее, при некоторых заболеваниях, сопровождающихся поражением брюшины, абсолютно очевидно, что причиной неудачи лечения становятся метастазы в регионарные лимфатические узлы, печень и органы за пределами брюшной полости. Следовательно, для эффективного лечения, учитывающего биологию развития рака, требуется применять ФДТ в комбинации с хирургическим лечением и химиотерапией. В случае рака яичников оперативное вмешательство в сочетании с химиотерапией, вероятно, останется стандартным вариантом начала лечения. При этом ФДТ будет играть заметную роль у больных с высоким риском остаточных микроскопических метастатических поражений. Аналогично у пациентов с новообразованиями органов желудочно-кишечного тракта, сопровождающимися карциноматозом брюшины, ведущей терапией останется химиотерапия, что будет вызвано высоким риском метастатического поражения печени и органов забрюшинного пространства. Но при этом только с помощью химиотерапии не устранить карциноматоз брюшины, а совместное применение химиотерапии и ФДТ даст существенные результаты.
     Лечение злокачественной мезотелиомы - ещё один пример эффективного применения ФДТ при лечении злокачественных поражений слизистых. Хирургическое удаление первичной опухоли при злокачественной мезотелиоме плевры сопряжено с высоким риском местных рецидивов. Применение ФДТ может позволить эффективно уничтожить отдельные оставшиеся раковые клетки, что приведёт к существенному улучшению результатов лечения. Более того, использование ФДТ сделает возможным ограничиться плеврэктомией вместо экстраплевральной пневмонэктомии, снизив число послеоперационных осложнений и смертность.

Еще одна сфера, где представляется разумным оценить пользу от применения ФДТ - адъювантная местная терапия после хирургического удаления опухоли. Известно, что во многих случаях после резекции солидных образований остаются микроскопические очаги рака, которые могут привести к развитию рецидива или даже метастазов. В зависимости от формы рака и его локализации часто для снижения риска местного рецидива в послеоперационном периоде применяется лучевая терапия. Доза облучения ограничена толерантностью здоровых тканей, и в большинстве случаев возможен лишь один курс терапии. ФДТ может сыграть роль адъювантного местного лечения, особенно при локализациях, чреватых высоким риском местных рецидивов и тяжелыми осложнениями лучевой терапии. Вероятными областями применения и заболеваниями являются: брюшная полость после удаления злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта; саркомы, расположенные забрюшинно или поражающие кишечник и имеющие небольшие размеры; злокачественные глиомы; состояния после радикальной простатэктомии. Теоретически идеально применять ФДТ в ходе хирургического вмешательства, поскольку максимальная открытость позволит эффективно доставить свет к тканям с высоким риском рецидива, а также адекватно оценить дозу светового облучения.

Первым применением ФДТ, одобренным FDA (Food and Drug Administration) в США, стало паллиативное лечение обструктивного рака пищевода (Dougherty et al., 1998). В ходе рандомизированных клинических испытаний была доказана эффективность ФДТ при паллиативной терапии обструктивного рака как пищевода, так и бронхиального дерева (Moghissi et al., 1993; Lightdale et al., 1995). Теме не менее, трудно поверить, что это применение ФДТ приведет к серьёзным изменениям в онкологической помощи. Поверхностность цитотоксических эффектов ограничивает терапевтическое воздействие на большие, обтурирующие просвет опухоли, что делает лечение лишь временным и паллиативным. Вместе с тем, преимущества ФДТ перед наружным лучевым воздействием или брахитерапией неочевидны. Для устранения основного препятствия на пути внедрения ФДТ в качестве паллиативного лечения остается доказать, что ФДТ столь же эффективна, но ведёт к меньшему числу осложнений, чем при стандартных методах лечения. Это важно, поскольку основная цель паллиативного лечения - уменьшить симптоматику заболевания, а не вызвать дополнительные осложнения.

Существуют технологии для интерстициального лечения солидных злокачественных новообразований. В качестве примера можно привести злокачественные глиомы и рак простаты (Gutin et al., 1987; D'Amico и Coleman, 1996). Теоретически возможно видоизменить эти методики так, чтобы доставлять свет к глубокорасположенным опухолям. Эти исследования только начинаются, и основная сложность чисто техническая: ограничена возможность дозиметрии света, доставляемого интерстициально. Тем не менее, это преодолимое препятствие. Хороший пример - лечение местно-распространенного рака простаты. Так, после радикальной простатэктомии или лучевой терапии признаки прогрессии заболевания отсутствуют примерно у 70% пациентов (Bagshaw et al., 1993; Catalona и Smith, 1994). В то же время, эти методы лечения имеют ряд серьезных осложнений, включая импотенцию, недержание мочи и травмы прямой кишки. Огромный интерес представляет разработка методики минимально инвазивной ФДТ, сопровождающейся ограниченным поражением окружающих тканей. Для внедрения радиоактивных источников в ткани простаты разработаны приспособления, которые могут быть адаптированы для доставки оптических волокон и света. Интерстициальная доставка света также может быть разработана и для других органов, включая легкие, поджелудочную железу и головной мозг.

Поражения кожи и слизистых (глотка, гортань, мочевой пузырь и т.д.) изначально были областью применения ФДТ. Эти локализации по прежнему остаются приоритетными в силу простоты доставки света (например, с помощью эндоскопической техники). Тем не менее, возможности терапии были серьёзно ограничены из-за высокого риска тяжелых форм кожной светочувствительности, развивавшейся после назначения фотосенсибилизатора первого поколения - производного гематопорфирина (HpD) (Dougherty et al., 1990; Moollooly et al., 1990). Таким образом, ФДТ в большинстве случаев заключалась в однократном назначении HpD с последующим однократным и двукратным облучением.
     Несколько фотосенсибилизаторов второго поколения, использованных в недавних клинических испытаниях, вызывают кожную фотосенсибилизацию, существенно менее длительную, чем при применении HpD (Wagnieres et al., 1998; Panella et al., 1998). Помимо большей длины волны в области пика поглощения, избирательности накопления и более глубокого проникновения в ткани, более быстрое выведение из организма фотосенсибилизаторов второго поколения позволяет применять ФДТ еженедельно или раз в две недели. Это может привести к более широкому использованию этого варианта лечения при поражениях кожи и слизистых, ведь сих пор специалистов поражала эффективность даже однократного применения ФДТ.

Роль ФДТ в терапии рака меняется. На сегодня ФДТ одобрена как метод паллиативной терапии таких далеко зашедших форм рака, как обструктивное поражение пищевода или бронхов. Будущее ФДТ, по нашему мнению, заключается в применении её в тех клинических ситуациях, где наилучшим образом можно использовать сильные стороны этой терапии. К числу таких ситуаций относятся предраковые заболевания или рак in situ, злокачественные поражения серозных оболочек, адъювантная терапия при хирургических вмешательствах и интерстициальное лечение глубоко расположенных опухолей. Крайне необходимы методики адекватной дозиметрии света и фотосенсибилизаторов, что позволило бы более тщательно разрабатывать методики лечения рака с помощью ФДТ.
     В 1993 году в Канаде Комитет по здравоохранению одобрил применение ФДТ с использованием Фотофрина при лечении рецидивного поверхностного рака мочевого пузыря. В Нидерландах лицензирована терапия рака легких и пищевода с применением Фотофрина. Впервые в мире в Японии в октябре 1994 года было выдано правительственное одобрение. В апреле 1996 года ФДТ была официально разрешена при лечении рака легкого, пищевода желудка и шейки матки (Kato et al, 1996). В нескольких странах были также законодательно утверждены регламентирующие документы по разным аспектам применения ФДТ. Наиболее перспективной представляется терапия опухолей малой толщины, что обусловлено их локализацией. Например, при поражениях кожи или ранних стадиях рака дыхательного, пищеварительного, мочевыделительного трактов и половой системы. Другой вероятной областью применения ФДТ является ее совместное использование с хирургическим вмешательством или химиотерапией при мезотелиоме плевры или карциноматозе брюшины. Новейшие разработки указывают на возможность применения ФДТ в качестве предоперационной подготовки при распространенных формах бронхогенного рака, эзофагите Барретга а также при пересадке красного костного мозга.

В настоящее время рассматривается возможность применения ФДТ при инфекционных и неонкологических заболеваниях. Проблема инфекционных заболеваний остается одной из главных во многих областях медицины. Сегодня наиболее агрессивными и устойчивыми к антибактериальным препаратам являются такие широко распространенные патогены, как E. coli, S. aureus, стрептококки [1, 2]. При тяжелой форме инфекции - сепсисе - наиболее часто встречающимися патогенными микроорганизмами являются стафилококки, грибы, энтерококки [3, 4]. Устойчивость возбудителей к антибиотикам и необходимость проведения системного лечения создают множество вторичных проблем (проблемы нефро-, гепато- и нейротоксичности). Одна из таких проблем - проблема системной токсичности антибактериальных препаратов. Она может быть рассмотрена с точки зрения "волшебной пули" [5], гипотетически представляющей антимикробное средство, целевым образом доставляемое в очаг поражения и взаимодействующее только с возбудителем инфекционного заболевания, но не с тканями и клетками организма-хозяина. В данном контексте таким средством представляется ФДТ.

В начале XX века идею "волшебной пули" высказал Paul Erlikh, предположив, что инкубация бактерий с красителем метиленовым голубым должна вызывать их гибель при световом воздействии.
      В настоящее время антимикробная фотодинамическая терапия (АФДТ) [5, 6] использует опыт, накопленный при ФДТ опухолей. Локальное распределение фотосенсибилизатора, локальное световое воздействие, применение световолоконной оптики и эндоскопической техники позволяют в некоторых случаях получать хороший клинический эффект.
      До сих пор наиболее активно исследуемой областью АФДТ являются исследования in vitro межклеточного взаимодействия активизированного фотосенсибилизатора и возбудителя инфекционного заболевания. Исследованы практически все фотосенсибилизаторы и красители, все источники света и большинство возбудителей инфекционных заболеваний.
      Так, Z.Malik с соавторами [7] в ставшем классическим обзоре сообщил о бактерицидном действии ФДТ на S. aureus, Streptococcus pyigenes, Clostridium perfingens, E. coli, Micoplasma hominis, грамотрицательные микроорганизмы и дрожжевые грибки [7].
      В 1990 г. появилось сообщение о том, что выделенные из мертвой ткани Helicobacter pylori после инкубации с сульфированным фталоцианином алюминия были успешно убиты излучением лазера с длиной волны 675 нм в дозе 1,5 Дж/см2. Отмечено, что повреждающего действия на слизистую оболочку такая доза не оказала [8]. Вопросы фотодинамической инактивации Helicobacter pylori и ее эффективность по сравнению с классической эрадикационной терапией были рассмотрены в 1992 г. на 57-м конгрессе Американской школы гастроэнтерологии. Причем, несмотря на отсутствие широкомасштабного клинического эксперимента, предпочтение явно было отдано фотодинамической инактивации [9].

Ведется поиск повышения эффективности антибактериальной терапии с использованием стандартных коммерческих антибактериальных препаратов и лекарственных средств путем изменения их фотохимических свойств воздействием когерентного и некогерентного излучения различного диапазона. Так, P.Bilski с соавторами [10] показал, что эндогенный витамин B6 (пиридоксин) в сочетании с нелазерным излучением УФ-диапазона (400-550 нм) оказывает выраженный токсический эффект на грибы семейства Cercospora in vitro. Антибактериальные препараты группы флуорхинолонов (офлоксацин, ломефлоксацин), разрешенные к клиническому применению во многих странах, способны при УФ-облучении генерировать активные формы кислорода (АФК), чем и объясняется их кожная фототоксичность при воздействии солнца [11].

Бактерицидное и бактериостатическое воздействие АФДТ на возбудителей инфекционных заболеваний осуществляется посредством генерации синглетного кислорода и перекисных радикалов фотосенсибилизаторами, находящимися вне- и внутриклеточно, с последующим развитием каскада фототоксических реакций. J.Schneider с соавторами [12] показал, что АФДТ с метиленовым синим и облучением широкополосным белым светом (400-700 нм) в дозе 10 Дж/см2 вызывает инактивацию РНК Qb-бактериофага in vitro посредством ее сшивки с плазматическими протеинами. Отмечаемая в некоторых случаях задержка роста бактериальной культуры in vitro при проведении АФДТ вызывается оксидантным стрессом, что тоже может оказаться полезным при клиническом применении. Способность бактериальной клетки in vitro выживать после оксидантного стресса зависит от активности ее супероксиддисмутазы, как в случае со штаммами, или от количества и активности ее белков теплового шока, как в случае с микобактериями, в условиях оксидантного стресса продуцирующими 2 типа белков теплового шока - HSP-70 и HSP-90. В этой связи представляет интерес комбинированное воздействие АФДТ на микобактерии туберкулеза in vitro с сульфированным фталоцианином алюминия и лазерного излучения с диной волны 675 нм в дозе 20 Дж/см2. Для исследования были использованы жизнеспособные культуры M. tuberculosis. Динамику роста культур оценивали по количеству и величине колоний каждые 10 дней в течение 60 дней. На 7-й день культуры подвергли воздействию ФДТ. Результатом явилась отчетливая задержка роста колоний микобактерий. В контроле (только фотосенсибилизатор и только лазерное воздействие) задержки роста колоний не наблюдали.

Таким образом, АФДТ инфекционных заболеваний, вызванных бактериальными возбудителями (рис.1), представляет собой процесс активного взаимодействия АФК и токсичных радикалов с антистрессорными факторами бактерий, исходы которого могут быть различными в зависимости от интенсивности генерации АФК, активности антистрессорных протеинов, антиоксидантных ферментов бактерий и многих других факторов.

Клинический эффект ФДТ в лечении вазотрофических нарушений при хронической венозной недостаточности нижних конечностей с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда е6 и лазерного полупроводникового аппарата "Кристалл 2000 (660 нм; 3 Вт)", выпускаемого российской фирмой "Техника-Про" (рис.2), достигнут на кафедре госпитальной хирургии Самарского государственного медицинского университета с участием профессоров Б.Жукова и С.Мусиенко. Фотохлорин использовали в виде аппликаций на язвенную поверхность за 2 часа до проведения сеанса ФДТ в дозе 0,5 мл/см2. Лазерное воздействие осуществляли дистанционно с помощью стандартных световодов. Параметры ФДТ (доза излучения, время экспозиции, количество процедур) подбирались индивидуально с учетом конкретных адаптационных характеристик пациента, сроков возникновения заболевания, размеров язвы, вида микрофлоры и показателей бактериальной обсемененности, а также фазы раневого процесса. Анализ результатов проводился на основании данных клинических исследований, иммунологического статуса, исследований микроциркуляторного русла, морфологических (цитологических, цитобактериологических), планиметрических, микробиологических, патофизиологических методов обследования, исследования уровня перекисного окисления липидов. На основании полученных данных были сделаны выводы о выраженном антибактериальном эффекте ФДТ, ускорении некролитической фазы раневого процесса, появлении активного грануляционного процесса и, в конечном итоге, ускорении в 1,5 - 2 раза сроков предоперационной подготовки больных к аутодерматопластике.

Злокачественные новообразования с вовлечением брюшины
     Диссеминированные злокачественные заболевания брюшной полости могут вызывать хроническую боль, приводить к обструкции желудочно-кишечного и мочевыводящего трактов, а также к перфорации органов. Их лечение представляет серьезную клиническую проблему. Хотя побочные токсические эффекты при применении лучевой и химиотерапии крайне выражены, у некоторых пациентов удается получить определенный эффект. Вместе с тем, карциноматоз брюшины обычно резистентен к большинству методик лечения. Интерес к ФДТ диссеминированных опухолей брюшной полости появился после работы Tochner и соавторов (Tochner et al., 1986), сообщивших о результатах лечения асцитного варианта опухоли путем внутрибрюшинного введения производного гематопорфирина (HpD) за 2 часа до облучения лазером (10 мВт, 514нм), продолжавшегося 16 минут. Было обнаружено, что через 2 часа после введения в опухолевой ткани накапливалось в 5-12 раз больше HpD, чем в нормальной. В общей сложности было проведено 4 сеанса ФДТ с интервалом в 2 дня. Все опухолевые узлы оказались чувствительны, а 85% из них были излечены.

В Rooswell Park Memorial Institute проводилось изучение целесообразности адъювантной ФДТ при рецидиве забрюшинной саркомы (Nambisan et aJ., 1987). У 10 пациентов рецидивы появились после обычной терапии. Все больные были повторно оперированы, а ложе опухолей подверглось интраоперационной ФДТ. У 8 из 10 пациентов было выполнено максимально полное удаление опухоли. Двое пациентов с заведомо нерадикальной операцией прожили без рецидивов 28 и 24 месяца. Никаких осложнений терапии не наблюдалось.

У 23 пациентов (13 с опухолями яичников, 8 с саркомой и 2 с псевдомиксомой брюшной полости) был проведена внутриабдоминальная ФДТ (Sindelar et al., 1991). После удаления опухоли поверхность брюшины облучалась лазером с длиной волны 630 нм с постепенным нарастанием дозы от 0,2 до 3 Дж/см2. После лечения у 5 из 8 пациентов был получен отрицательный результат цитологического исследования смыва из полости брюшины на атипичные клетки. У 6 пациентов клиника заболевания отсутствовала на протяжении 18 месяцев наблюдения, а у 5 пациентов развились осложнения, связанные с терапией (Sindelar et al., 1991).

В трех случаях рецидива рака яичников был использован новый фотосенсибилизатор - мезотетрагидроксифенилхлорин (m-THPC, темопорфин) (Wirrani et al., 1997). У 2 из 3 больных ФДТ проводилась при лапароскопии. У всех 3 пациентов не было признаков заболевания на протяжении 2 лет после терапии. Это исследование показывает, что у т-ТНРС есть существенные преимущества, такие как более низкий уровень фототоксичности и более глубокое проникновение лазерного излучения в ткани.
     Имеется сообщение о первой фазе клинических испытаний, в которых участвовало 54 пациента (DeLaney et al., 1993). Сначала использовалось излучение с длиной волны 630 нм в дозе 2,8-3,0 Дж/см2. Однако, при этом во всех случаях наблюдался отек тонкой кишки, а у 3 больных наступила перфорация. Увеличение дозы излучения до 3,75 Дж/см было достигнуто применением зеленого света (514нм), но и при этом во всех случаях наблюдались осложнения со стороны тонкой кишки.

Все возрастающая роль лапароскопии в абдоминальной хирургии позволяет проводить дополнительное облучение светом через лапароскоп сразу после резекции опухоли и до формирования спаек.
     Представляется разумным продолжать исследование внутрибрюшной ФДТ, чтобы уточнить максимальные дозы и научиться доставлять ударные дозы в трудно доступные анатомические области с высоким риском развития опухолей. Для выяснения терапевтических преимуществ ФДТ при диссеминированных неоплазмах брюшной полости требуется провести II-III фазы клинических испытаний.

Злокачественная мезотелиома
     Ежегодно в США регистрируется 3-4 тысячи случаев злокачественной мезотелиомы плевры (Qua et al., 1993). Вместе с тем результаты лечения этого заболевания остаются не удовлетворительными. При имеющихся методах лечения средняя продолжительность жизни составляет 6-16 месяцев (Antman et al., 1989). Поскольку нет единого стандарта терапии злокачественной мезотелиомы, очевидна потребность в новых методах лечения. Редко удается выполнить радикальную резекцию. Макроскопически резекция может казаться полной, но микроскопически в плевре часто обнаруживаются опухолевые клетки. Комбинированное лечение хотя и дает некоторые позитивные результаты, однако общая выживаемость существенно не увеличивается.

Первое сообщение о фазе I клинических испытаний внутриполостной ФДТ при карциноматозе брюшины привлекло много внимания (Pass et al., 1990). Впоследствии Takita и Dougherty провели II фазу клинических испытаний, в которой изучалось сочетание хирургического вмешательства и внутриполостной ФДТ у 31 пациента со злокачественной мезотелиомой плевры (Takita и Dougherty, 1995). В этом исследовании через 48 часов после внутривенного введения 2 мг/кг Фотофрина выполнялась операция плевропневмонэктомии или плевроэктомии, при которой удалялась основная масса опухоли. После этого с помощью аргонового лазера с красителем проводилось облучение плевральной полости в дозе 20-25 Дж/см при длине света 630 нм. Среднее время выживаемости для пациентов на всех стадиях опухолевого процесса составило 12 месяцев: на стадиях Ш и IV - 8 месяцев, а средняя продолжительность жизни для 9 пациентов на стадии I и II - 21 месяц.

В самом крупном исследовании участвовало 42 пациента, в котором на фазе I клинических испытаний проводилась ФДТ с использованием HpD: 31 пациент (74%) умер и увеличение процента выживаемости не наблюдалось (12,4%) (Pass et al., 1994). ФДТ выполнялось с использованием 2 аргоновых лазеров с красителем спустя 48 часов после введения Фотофрина в дозе 2 мг/кг. Точное время облучения лазером составляло 68 минут, что давало общую дозу света, равную 25 Дж/см2.
     Хотя во всех предыдущих исследованиях и признавался огромный потенциал ФДТ, нехватка высокоэнергетических лазеров, эффективных фотосенсибилизаторов, недостаточное понимание дозиметрии и невозможность назначения оптимальных доз за короткий период времени препятствовали более широкому использованию этого метода лечения. В пилотном исследовании, в котором использовались m-THPC в дозе 0,3 мг/кг и лазер в дозе 10 Дж/см2, участвовало 8 пациентов (Ris et al., 1993, 1996). После проведенной терапии у 7 пациентов местные проявления опухоли отсутствовали, но через 4-18 месяцев появились отдаленные метастазы. У 1 пациента, умершего от легочной эмболии через 8 дней после операции, на вскрытии выявлялся выраженный некроз оставшейся опухоли, однако, наблюдалось также фотоиндуцированное повреждение, таких органов, как сердце и пищевод. Baas и соавторы также лечили 5 пациентов со злокачественным заболеванием плевры, используя ФДТ (Baas et al., 1997). Применялся высокоэнергетический диодный лазер с длиной волны 652 нм. В качестве фотосенсибилизатора был взят m-THPC. Доставка света к поверхности грудной полости контролировалась in situ с помощью изотропных датчиков света. Ориентация волокна, по которому доставлялся свет, изменялась для достижения оптимального распределения света в грудной полости, при этом принимались во внимание как отражение, так и рассеивание. При использовании этой системы возможна доставка света к обширным поверхностям за короткий период времени. Дозиметрия in situ обеспечивает оптимальное распределение света и позволяет отслеживать общие дозы облучения в различных точках грудной полости (Baas et al., 1997). Эта комбинация доставки света и дозиметрии хорошо подходит для вспомогательной ФДТ при злокачественных опухолях плевры. Практически нет сомнений, что дальнейшие эксперименты позволят повысить эффективность этой методики.

Предоперационная ФДТ при раке легкого
     В настоящее время при раке легкого ФДТ в основном выполняется на ранних стадиях, когда результаты и так вполне удовлетворительны (Kato et al., 1996). Однако, хотя в Японии за последнее время достигнуты серьезные успехи в массовом скрининге и диагностике, большая часть случаев этого заболевания по-прежнему выявляется на поздних стадиях. Как и следовало ожидать, лучшие результаты были получены после хирургического лечения по сравнению со случаями, когда удаление опухоли не выполнялась (Mountain, 1985). В силу этого необходимо увеличить число операбельных случаев рака легкого, что неминуемо приведет к росту выживаемости. Кроме того, даже после радикальной резекции 15% пациентов умирает после операции из-за дыхательной недостаточности, поэтому у больных со снижением функциональных показателей целесообразно уменьшать объем операции.

Предоперационная ФДТ применяется как один из вариантов повышения операбельности и уменьшения объема вмешательства при раке легкого (Kato et al., 1985). Konaka и соавторы сообщили о результатах лечения 25 пациентов, которым была выполнена предоперационная ФДТ, чтобы либо уменьшить объем резекции, либо повысить операбельность (Konaka et al., 1995). Через 48 часов после внутривенного введения 2,0 мг/кг массы тела Фотофрина под местной анестезией бронхоскопически выполнялась ФДТ. Спустя 2-9 недель производилась операция. В трех случаях поражения трахеи у одного пациента была выполнена правосторонняя верхняя лобэктомия с резекцией главного бронха, у одного - пневмонэктомия, а у последнего - пластика трахеи. В 3 случаях при вовлечении в процесс карины трахеи одному пациенту выполнена лобэктомия другому - левосторонняя пневмонэктомия, а третий пациент подвергся эксплоративной торакотомии из-за обширного метастатического поражения лимфатических узлов корня легкого. Из 19 случаев поражения главного бронха у 7 больных выполнена лобэктомия, а 10 - лобэктомия с резекцией главного бронха. В оставшихся 2 случаях из-за поражения лимфоузлов корня пришлось выполнить пневмонэктомию. У 22 из 25 пациентов после применения ФДТ была достигнута поставленная цель, то есть либо уменьшение объема резекции, либо перевод неоперабельного заболевания в операбельное. 4 из 5 пациентов, первоначально отнесенных к неоперабельным, после ФДТ подверглись хирургическому вмешательству. У 18 из 20 пациентов, рассматривавшихся как кандидаты на пневмонэктомию, стало возможным уменьшить объем операции до лобэктомии или лобэктомии с резекцией главного бронха. Уровень 5-летней выживаемости, вычисленный по методу Каплана Майера для 10 пациентов, находившихся в стадии Ш а и получивших предоперационную ФДТ с последующей лобэктомией, оказался равным 59,3%. Таким образом, новый подход к предоперационному использованию ФДТ может оказаться ценным в лечении распространенных злокачественных опухолей легких и расширит область применения ФДТ при раке легкого.

Очистка костного мозга при пересадке
     При лейкемиях и некоторых солидных опухолях эффективным комбинированным лечением является химиотерапия высокими дозами препаратов и аутологичная трансплантация красного костного мозга. Клинические испытания свидетельствуют о высоком потенциале этой методики при терапии острых лейкозов и неходжкинской лимфомы. Пересадка аутологичного красного костного мозга имеет ряд преимуществ, наиболее значимыми из которых являются снижение риска отторжения трансплантата, вирусных инфекций, и лимфопролиферативных расстройств из-за манипуляций с трансплантатом. Однако, число рецидивов при пересадке аутологичного костного мозга выше, чем при использовании аллогенного: во-первых, поскольку аутологичные трансплантаты не имеют реакций "трансплантат против хозяина", характерных для аллогенных трансплантатов; а во-вторых, поскольку в аутологичных трансплантатах могут сохраняться опухолевые клетки. Для снижения содержания опухолевых клеток в аутотрансплантатах костного мозга используются химические агенты или моноклональные антитела (Mulroney et al., 1994). Одной и новейших техник эктракорпоральной очистки красного костного мозга является ФДТ. Для фотодинамического контроля над красным костным мозгом, полученным от больных во время ремиссии, предложено несколько фотосенсибилизаторов, включая Фотофрин, производное бензопорфирина (BPD) и мероцианин 540 (МС540) (Fisher et al., 1995). Трансплантаты костного мозга представляют собой суспензию свободно плавающих клеток, которые легко подвергнуть равномерному воздействию фотосенсибилизатора и света. Серьезным преимуществом этой техники является возможность удалить препарат перед реинфузией клеток пациенту, чтобы избежать системной фотосенсибилизации (Sieber и Krueger, 1989). Имеется сообщение, что ФДТ может снизить содержание клоногенных промиелоцитарных лейкозных клеток и клеток при хроническом миелоидном лейкозе на величину, кратную 8 log (Atzpodien et al., 1986). При этом удается сохранить 50% полипотентных гемопоетических клеток-предшественников.

По итогам этих исследований были начаты клинические испытания, целью которых стала оценка возможностей ФДТ при пересадке красного костного мозга. Исследования токсических влияний ФДТ при использовании МС 540 для очистки костного мозга при лейкозах и лимфомах находится на фазе I клинических испытаний. Sieber (1987) сообщил, что при ФДТ с применением МС 540 in vitro удавалось на 4-5 порядков снизить количество клеток неходжкинской лимфомы в материале, полученном от пациента, при этом доза препарата позволяла сохранить около 50% нормальных гемопоэтических клеток-предшественников. В дальнейших исследованиях планируется при лечении пациентов высокими дозами бусульфана и циклофосфамида "спасать" пациентов путем пересадки аутологичного костного мозга, очищенного с помощью ФДТ.

Эзофагит Барретта
     ФДТ использовалась в качестве терапии ранних или поверхностных опухолей пищевода и представляет собой вероятную альтернативу эзофагэктомии (Overbold и Panjehpour, 1995). В нескольких странах уже закончена III фаза клинических испытаний применения ФДТ для лечения поверхностных опухолей и паллиативной терапии при злокачественной дисплазии пищевода. В Канаде, Японии, США, Нидерландах и Франции получено официальное одобрение этой методики. Также исследуется эффективность ФДТ при эзофагите Барретта, представляющем собой прогрессирующее замещение нормального плоского эпителия пищевода призматическим, что сочетается у некоторых пациентов с диафрагмальной грыжей и эзофагитом (Barren, 1950). Частота развития рака у больных эзофагитом Барретта в 30-40 раз выше, чем в остальной популяции (Cameron et al., 1985). Это заболевание развивается примерно у 10% больных (Sjogren и Johnson, 1983). При эзофагите Барретта в случае аденокарциномы и в некоторых случаях тяжелой дисплазии рекомендована эзофагэктомия. Однако, хирургическое вмешательство связано с высоким уровнем осложнений и смертности (Rice et al., 1993). В силу этого возникла необходимость в альтернативной неинвазивной терапии.

Overbold и Panjehpour (1995) сообщили о результатах ФДТ 12 пациентов с дисплазией пищевода. У 5 из этих больных на фоне эзофагита Барретта наблюдалась аденокарцинома. Свет доставлялся через стандартный диффузор или центрующий пищеводный баллон. Все пациенты в течение длительного времени получали омепразол, чтобы снизить кислотность после ФДТ. У пациентов с эзофагитом Барретта и поверхностным раком пищевода после ФДТ наблюдалось отторжение диспластической и озлокачествленной слизистой. После этого у всех пациентов отмечалось заживление и частичное замещение патологической слизистой нормальным плоским эпителием, а у 3 больных описано полное замещение здоровыми клетками. У 4 пациентов с выраженным циркулярным отторжением слизистой в проксимальной или средней частях пищевода заживление сопровождалось стриктурами, которые успешно лечились дилатацией. Исследователи показали также, что баллонная техника эффективнее использования диффузора при таких обширных поверхностных поражениях, как дисплазия. Но, более точное местное облучение при ФДТ строго локализованных поражений дает применение диффузора. В ходе лечения у пациентов с общей дозой света, равной 300 Дж/см2, после сеанса ФДТ развивалась умеренная боль в грудной клетке, что заставляло ограничивать протяженность отрезка пищевода, подвергавшегося ФДТ в ходе одного сеанса, 5-7 см. ФДТ эзофагита Барретта может оказаться эффективной па нескольким причинам. Так, эзофагит Барретта может захватывать протяженные участки пищевода, а диспластические изменения часто мультифокальны и распределяются непредсказуемо. При возникновении дисплазии в плоской барреттовской ткани, отличить ее от нормальных окружающих тканей невозможно. В этом случае селективность ФДТ в отношении патологичских тканей является преимуществом.

Вещества, применяемые в ФДТ
     Первое поколение фотосенсибилизаторов основывалось на гематопорфирине (Нр) и производном гематопорфирина (HpD). Последний представляет собой смесь веществ, имеющих в своей основе порфириновую структуру. Впервые действие гематопорфирина на человеческий организм испытал в сенсационном эксперименте на себе самом F.Meyer-Betz [13]. 14 октября 1912 г. он ввел себе внутривенно 0,2 г гематопорфирина и продемонстрировал солнечную фоточувствительность в виде отека и гиперпигментации, которые продолжались в течение 2 месяцев (рис.3). Последующие исследования подтвердили, что системное применение гематопорфирина вызывает интенсивную фотосенсибилизацию различных тканей, в том числе кожи.

Диагностическое значение основанной на использовании гематопорфирина флюоресценции неопластических тканей подчеркнул A.Policard в 1924 г. [14]. Он предположил, что красная флюоресценция, вызываемая ультрафиолетовым светом на экспериментальных саркомах крыс, обусловлена накоплением эндогенного гематопорфирина вследствие вторичного инфицирования гемолитическими бактериями.
     В 1954 г. группе из 11 больных раком гематопорфирин был введен внутривенно в дозах от 300 до 1000 мг за 12-72 ч до операции [15]. Яркая красная флюоресценция визуализировалась во время операции при облучении ближним ультрафиолетовым светом. Было сделано заключение, что красную флюоресценцию гематопорфирина и его тенденцию концентрироваться в опухолях можно использовать, чтобы во время операции выявить невидимые глазом опухоли и определить их границы. Мелкие или незаметные лимфатические узлы также можно обнаружить с помощью этой фотодинамической техники.
     Важным в развитии современной ФДТ явилась разработка фотосенсибилизатора с улучшенными свойствами - производного гематопорфирина (HpD), так как сам гематопорфирин представляет собой смесь порфиринов и инертных примесей [16]. Производное гематопорфирина оказалось вдвое более токсичным, чем первоначальный препарат, и оказывает в 2 раза более высокое фотодинамическое действие. Впервые HpD получил S.Schwartz путем обработки гематопорфирина концентрированной серной и уксусной кислотами и применил в клинике Мейо (США) в 1960 г. для выявления опухолей [17].

В 1978 г. T.J.Dougherty с соавторами [18] описал полный или частичный эффект ФДТ с HpD 111 из 113 кожных или подкожных очагов злокачественных опухолей человека. Интенсивно пигментированные или большие опухоли требовали больших доз HpD. Избежать повреждения нормальной окружающей кожи удавалось путем снижения доз света или увеличения временного интервала между введением фотосенсибилизатора и световым воздействием. Авторы считали лазерное излучение эффективной альтернативой свету дуговой лампы и использовали для ФДТ перестраиваемый лазер на красителях с аргоновой накачкой и подведение света по волоконным световодам [19]. Главное преимущество лазера, по мнению авторов, состоит не в интенсивности или длине волны, а в возможности использования гибких световодов.
     Как выяснилось значительно позже, HpD представляет собой неочищенную смесь порфиринов, все еще в значительной степени неактивных или имеющих слабую фотосенсибилизирующую активность. Сам гематопорфирин составляет около 20% этой смеси, продукты его монодегидратации, в том числе гидроксиэтилвинилдейтеропорфирин - 25%, продукты дидегидратации протопорфирина - 5% [20, 21]. Вторая половина этой смеси состоит из порфиринов, соединенных эфирными связями в комплексы размером от 2 до 8 пиррольных колец. Эти соединения, обусловливающие биологическую активность HpD, можно отделить от других компонентов различными хроматографическими методами.

Препарат, содержащий как минимум 80% этих активных фракций, известен [22] как Фотофрин II (Photofrin II), Porfimer Sodium или Эфир дигематопорфирина (DHE). Этот препарат был разрешен Американским комитетом по пищевым добавкам и лекарствам (FDA) для клинических испытаний, прошел 3-ю фазу клинических испытаний при спонсорской поддержке производящими его компаниями Photomedica Inc (NJ, USA), Quadra Logic Technologies (Vancouver, Canada) и American Cyanamid Lederle Laboratories (NY, USA). Он неплохо зарекомендовал себя в качестве фотосенсибилизатора при ФДТ различных злокачественных новообразований. В настоящее время Фотофрин II является самым распространенным в мире фотосенсибилизатором. Его называют "рабочей лошадкой" ФДТ. При введении в организм экспериментальных животных он накапливается во всех тканях и органах ретикулоэндотелиальной системы (например, в печени, почках, селезенке), а также в опухолевой ткани, хотя и в меньшей концентрации [23]. В опухолевой ткани он задерживается на более длительное время, чем в нормальных тканях (у крыс - до 12 недель). Тем не менее, стойкая задержка в коже даже минимальной концентрации фотосенсибилизатора требует от пациентов соблюдения ограниченного светового режима, т.е. предохранения от попадания на кожу яркого света, особенно солнечного, в течение 4-6 недель, чтобы избежать реакции кожи наподобие солнечного ожога.

Полным аналогом Фотофрина II в России является первый отечественный фотосенсибилизатор Фотогем (Photohem), созданный в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова под руководством профессора А.Ф.Миронова в 1990 г. Фотогем представляет собой смесь мономерных и олигомерных производных гематопорфирина. Он не имеет запаха, растворим в водных растворах гидроокиси натрия, в диметилсульфоксиде и уксусной кислоте; ограниченно растворим в этиловом спирте; практически не растворим в воде, хлороформе и диэтиловом эфире. Фотогем выпускается по оригинальной технологии из дефибринированной крови животных и человека. Электронный спектр раствора Фотогема в смеси диметилсульфоксида с уксусной кислотой и толуолом в соотношении 1:1:1 имеет максимумы поглощения при 396, 504, 570 и 633 нм. При поглощении Фотогем способен переходить в возбужденное состояние и затем либо флюоресцировать в красной области спектра, либо вызывать фототоксичные реакции в опухолевой ткани. Указанные свойства позволяют использовать его как для диагностики опухоли, так и для ее удаления.
      Фотогем выпускается в стерильных флаконах объемом 50 мл в виде порошка темно-бурого цвета массой 260 мг. Для получения рабочего раствора во флакон с препаратом, завернутый в светонепроницаемую бумагу, вводится 40 мл стерильного физиологического раствора. Флакон встряхивается и выдерживается 3-5 мин для осаждения пены. Необходимая доза рассчитывается, исходя из 0,5% концентрации действующего вещества (т.е. 5 мг в 1 мл раствора Фотогема) и веса тела пациента. Введение препарата производится внутривенно, капельно или струйно при горизонтальном положении больного.

Клинические испытания Фотогема впервые были предприняты в феврале 1992 г. и успешно завершены в 1996 г. В настоящее время испытанный в ряде московских НИИ Фотогем разрешен Министерством Здравоохранения России для широкого клинического применения. На сегодняшний день курс ФДТ с этим препаратом прошли более 1500 больных. Выраженный терапевтический эффект получен у 91% пациентов. При этом в 62% случаев наблюдалось полное исчезновение опухолей, а частичная регрессия (уменьшение опухоли более чем в два раза) - в 29% случаев. При ранних формах рака полное излечение наблюдается у 92% пациентов.

В 1994 г. в России начаты клинические испытания фотосенсибилизатора второго поколения - Фотосенса (Photosense). Препарат разработан в Московском научно-производственном объединении "НИОПИК" (рис.4) под руководством профессора Г.Н.Ворожцова (рис.5). Фотосенс представляет собой раствор смеси натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия от ди- до тетразамещенного в дистиллированной воде. Раствор прозрачный интенсивного сине-бирюзового цвета, без запаха. Фотосенс обладает интенсивной полосой поглощения в красной области спектра с максимумом в водном растворе при 675 нм. Вторая, значительно менее интенсивная полоса поглощения расположена при 350 нм. Фотосенс имеет ряд преимуществ перед фотосенсибилизаторами первого поколения на основе производных гематопорфирина: высокую фотодинамическую активность в красной области спектра, большую прозрачность ткани для излучения используемого лазера и, следовательно, возможность лечить более глубоко расположенные опухоли. Препарат вводят в условиях полузатемненного помещения внутривенно или капельно в однократной дозе 1 - 2 мг/кг массы тела пациента с предварительным разведением стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:4 за 24-48 ч до лазерного облучения опухоли (рис.6). В течение 6-10 недель после введения Фотосенса больной должен быть изолирован от яркого солнечного света. Форма выпуска Фотосенса - 0,2% раствор для инъекций в стеклянных флаконах по 50 мл. В настоящее время в ряде московских НИИ завершается 3-я фаза клинических испытаний этого препарата для ФДТ злокачественных новообразований и проводятся интенсивные исследования по ФДТ длительно незаживающих гнойных ран, трофических язв и других неопухолевых заболеваний.

В течение последнего десятилетия в ФДТ злокачественных новообразований большой интерес в качестве фотосенсибилизаторов вызывают тетрапиррольные соединения, в частности, производные ряда хлорофилла. При этом одной из проблем ФДТ по-прежнему остается повышение селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли, так как следствием низкой селективности является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету.

При синтезе тетрапирролов наблюдается тенденция к созданию соединений с заданными свойствами на основании структурно-функциональных свойств. Это применимо, в частности, к конструированию и получению новых фотосенсибилизаторов для ФДТ, характеризующихся повышенной туморотропностью и обладающих высокой цитофототоксичностью по отношению к опухолевым клеткам после облучения. В результате анализа большого объема экспериментальных и клинических материалов были сформулированы основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору, включающие биологические (токсические и фармакокинетические), фотофизические и химико-технологические критерии. Прежде всего это:

• низкая темновая и световая токсичность в терапевтических дозах;
• высокая селективность накопления в тканях злокачественных новообразований и быстрое выведение фотосенсибилизатора из кожи и эпителиальной ткани;
• сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК диапазоны);
• оптимум между величинами квантового выхода флюоресценции и квантового выхода интерконверсии, второй из которых определяет способность фотосенсибилизатора к генерации синглетного кислорода (в то же время, способность фотосенсибилизатора флюоресцировать обуславливает его диагностические возможности и облегчает контроль накопления и выведения его из тканей);
• высокий квантовый выход образования синглетного кислорода в условиях in vivo;
• доступность получения или синтеза, однородный химический состав;
• хорошая растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;
• стабильность при световом воздействии и хранении.

Основное ограничение метода ФДТ - глубина действия лазерного излучения. Используемые в клинике препараты имеют спектр фотодинамического воздействия с максимумами в области 620 - 690 нм. Проницаемость биологических тканей в этом диапазоне незначительна и составляет несколько миллиметров. Известно, что максимальная проницаемость тканей находится в дальней красной и ближней ИК области 750 - 1500 нм и соответствует диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров. Создание и внедрение фотосенсибилизаторов, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в этой области спектра, могло бы существенно расширить сферу применения ФДТ.

В настоящее время проводится направленный поиск таких фотосенсибилизаторов среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фталоцианинов. При этом особый интерес представляют фотосенсибилизаторы, обладающие способностью не только быстро накапливаться в опухолях, но и с высокой скоростью распадаться. Со временем, как это принято в химиотерапии опухолей, будет создан банк препаратов адресного спектра применения, адаптированных к определенным нозологическим и гистологическим формам рака.

Впервые водорастворимые производные хлорофилла предложил использовать для медицинских целей E.Snyder (США) в 1942 г. При пероральном или внутривенном применении хлориновых смесей, в основном содержащих хлорин р6, были отмечены низкая токсичность, гипотензивное, антисклеротическое, спазмолитическое, обезболивающее, противоревматоидное действие. При пероральном применении в дозах 1 г в день в течение 30 дней улучшались показатели биохимии крови, в частности, в 1,5-2 раза снижался уровень холестерина в крови. Это послужило показанием к использованию водорастворимых хлоринов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, ревматоидного артрита.

Первое упоминание об использовании производных хлоринового ряда для ФДТ касается производных феофорбида А, которые относятся к хлоринам. Некоторые из них были запатентованы в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ в 1984 г. в Японии.
      В научной литературе об использовании производных хлоринового ряда для ФДТ было заявлено в 1986 г., когда группа авторов из США (J.Bommer, Z.Sveida, B.Burnhem), исходя из оценки перспективности свойств хлорина е6, сообщила о результататах своего поиска фотосенсибилизатора, удовлетворяющего важнейшим требованиям ФДТ, а именно хорошей туморотропности и интенсивному поглощению в длинноволновой красной области спектра. Выбор был остановлен на моно-L-аспартил хлорине е6 (MACE), который в настоящий момент находится на завершающей стадии клинических испытаний в Японии. Одновременно в США (для японской компании Nippon Petrochemicals Company) J.Bommer и B.Burnhem заявили для патентования ряд функционализированных производных хлорина е6 и бактериофеофорбида А.

В 1994-2001 гг. в России были проведены систематические исследования тетрапиррольных макроциклов хлоринового ряда (производных хлорофилла А) с целью выявления структурно-функциональных закономерностей накопления фотосенсибилизаторов в опухоли, повышения терапевтического отношения и создания на их основе лекарственных субстанций и форм. В этот же период была разработана технология извлечения из растительного сырья комплекса биологически активных хлоринов, которые содержат в качестве основного компонента хлорин е6. В результате были созданы фотосенсибилизаторы второго поколения - Фотохлорин (Photochlorin) и Фотодитазин (Photoditazine). Препараты представляют собой 0,35% раствор для внутривенного введения и содержат композицию из трех циклических тетрапирролов хлориновой природы (с гидрированным кольцом D), основной из которых (80-90%) - хлорин е6. Фотохлорин и Фотодитазин способны разрушать биологические субстраты после возбуждения светом с длиной волны в диапазоне 654-670 нм, чему соответствует эффективная глубина проникновения света до 7 мм. Препараты имеют высокую степень фототоксичности, связанную с высоким квантовым выходом синглетного кислорода - одного из основных токсических агентов, образующихся под действием света при проведении ФДТ. Сохраняющаяся при этом способность препаратов флюоресцировать оставляет возможность для люминесцентной диагностики очагов неопластического изменения тканей. Для этого препараты возбуждают в любой из полос - 406, 506, 536, 608 или 662 нм и регистрируют интенсивную флюоресценцию при 668 нм. Для Фотохлорина и Фотодитазина характерны высокая водорастворимость и хорошая стойкость при хранении. Хранение препаратов в темноте при температуре 4?8°С не меняет их свойств в течение полутора лет.

В результате проведенных биологических испытаний установлено, что хлориновые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы обладают интенсивной полосой поглощения в длинноволновой области, оптимальным соотношением флюоресценция/интерконверсия и проявляют на порядок большую световую токсичность, чем большинство фотосенсибилизаторов, при отсутствии темновой токсичности. Общие токсические свойства при введении хлориновых фотосенсибилизаторов в организм оказываются лучше, чем у порфириновых олигомеров или сульфированных фталоцианинов, а скорости выведения препаратов из организма не сравнимы: Фотосенс и Фотогем сохраняются в организме на период более трёх месяцев против 2-х суток у водорастворимых хлориновых фотосенсибилизаторов.
      Свойства Фотохлорина и Фотодитазина позволяют радикально изменить саму технологию ФДТ в онкологической клинике, поскольку можно исключить этап продолжительного стационарного лечения, необходимый при использовании Фотофрина II, Фотогема или Фотосенса, заменив его однодневным стационаром или даже амбулаторным лечением. Оптимальным временем для облучения опухолей лазерным излучением в клинике можно считать 3-часовую точку (при внутривенном введении).

Клеточные аспекты ФДТ рака
     При ФДТ в клетках происходит очень сложный комплекс изменений. Мишенями фотохимических воздействий являются многие клеточные структуры: клеточные мембраны, митохондрии, ДНК и микротрубочки. Вслед за световым облучением, при котором, скорее всего, образуются свободные радикалы, в клетках повышается уровень кальция. Одновременно с этим или несколько позже по мере прогрессирования повреждения мембран могут наблюдаться и другие электролитные нарушения. Сублетальное повреждение клеток посредством вовлечения многих сигнальных систем может вызывать апоптоз. Тем не менее, in vivo важными могут быть и непрямые эффекты, такие как ишемический некроз вследствие повреждения сосудов. Эффекты ФДТ можно модулировать, меняя дозу, скорость введения, конъюгируя фотосенсибилизаторы с липопротеинами или липосомами и добавляя химиопрепараты. Многое еще предстоит изучить, и в дальнейшем, вероятно, будут более систематично изучены зависимости результатов терапии от типов клеток, фотосенсибилизаторов и условий лечения. Тем не менее, имеются все основания для оптимизма, поскольку уже накопленные знания являются прочной основой для проводимых клинических исследований.

Экономические аспекты ФДТ рака
     В заключение, остановимся на рассмотрении перспектив применения метода ФДТ в лечении рака. Для этого следует, прежде всего, оценить распространенность этой патологии и масштабы экономического ущерба от злокачественных новообразований.

Негативное психогенное влияние рака ощущают все живущие на земле. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в 2001 г. в мире выявлено более 10 млн. новых случаев рака и более 6 млн. смертей от рака. Лидирующими локализациями рака в мире являются рак желудочно-кишечного тракта (рак желудка, пищевода, толстой и прямой кишок) и рак легкого. Вместе рак желудочно-кишечного тракта и рак легкого составляют 47% среди 10 наиболее частых локализаций рака и 42% всех смертельных исходов от рака в мире.

Экономический ущерб от рака очень велик. По данным Национального института здоровья только в США в 2001 г. он составил до 180,2 биллионов долларов.
     Экономическую эффективность применения ФДТ проще всего и нагляднее всего рассматривать на примере наиболее распространенных опухолей, с одной стороны, и с учетом тех локализаций, которые доступны, с другой. Если при раке желудка и раке легкого выявление опухолей в начальной стадии (когда ФДТ оказывается наиболее эффективной) - относительно редкое явление, и поэтому вклад ФДТ при всех ее достоинствах в экономическом отношении невелик, то при раке кожи имеется совершенно другая, более благоприятная ситуация.

Доля злокачественных опухолей кожи среди новообразований, подвергнутых ФДТ, составляет 65-70% как в России, так и за рубежом, а лечебная эффективность достигает 100%.
     Если учесть возможности ФДТ при раке кожи (однократность сеанса в амбулаторных условиях) и сравнить их с затратами при традиционно применяемой близкофокусной рентгенотерапии, длящейся 2-3 недели, то станет очевидным, что ФДТ отличается значительной экономической эффективностью.
     Аналогичная ситуация имеется и при других наружных локализациях злокачественных новообразований. Сюда относятся рецидивы и внутрикожные метастазы рака молочной железы, первичные опухоли и многочисленные (до 60-70%) рецидивы рака языка, слизистой полости рта, нижней губы, внутрикожные метастазы меланомы и других опухолей.
     Неоценимой как в клиническом, так и в экономическом аспектах оказалось применение ФДТ с использованием эндоскопической техники для восстановления просвета пищевода, трахеи, крупных бронхов при их сужении раковой опухолью и для лечения злокачественных новообразований других внутренних органов, в том числе с локализацией опухоли в таких труднодоступных областях как панкреатодуоденальная зона и общий желчный проток. Таким образом, ФДТ имеет следующие преимущества:

1. ФДТ применяется, когда хирургическая операция невозможна из-за тяжелых сопутствующих заболеваний или распространенности опухоли. ФДТ избирательно разрушает раковые клетки и не повреждает нормальные здоровые ткани. Благодаря этому, после ФДТ, когда опухоль разрушена, нормальные клетки при своем размножении заполняют обнажившийся при разрушении каркас органа. Это особенно важно при ФДТ тонкостенных и трубчатых органов (желудок, толстая кишка, пищевод, трахея, бронхи, мочевой пузырь), т.к. предохраняет от образования сквозного дефекта и прободения стенки органа. Следовательно, если у пациента имеется злокачественная опухоль, которую нельзя удалить хирургически, ФДТ еще может быть применена для лечения таких опухолей.
2. ФДТ селективна. Фотосенсибилизатор избирательно накапливается в опухоли и почти не задерживается в окружающих опухоль нормальных тканях. Благодаря этому, в процессе ФДТ при локальном облучении красным светом избирательно (селективно) повреждается раковая опухоль, и не повреждаются окружающие ткани.
3. ФДТ позволяет избежать системного (общего) воздействия на организм человека, наблюдаемого, например, при химиотерапии опухолей. Лечение происходит только в том месте, куда направлен свет, следовательно, организм больного не подвергается нежелательному общему воздействию и таким образом удается избежать всех побочных эффектов химиотерапии (тошнота, рвота, стоматит, выпадение волос, угнетение кроветворения и т.д.).
4. ФДТ имеет низкую стоимость. Для большинства больных ФДТ - это неинвазивный или минимально инвазивный, щадящий, локальный, недорогой метод лечения многих разновидностей злокачественных опухолей (первичных, рецидивных, метастатических).

Министерством здравоохранения Российской Федерации проведен анализ результатов применения ФДТ в Москве при лечении злокачественных новообразований кожи, молочной железы, слизистой оболочки полости рта, языка, нижней губы, гортани, легкого, пищевода, желудка, мочевого пузыря, прямой кишки и других локализаций. В течение 1992 - 2001 гг. было подвергнуто лечению методом ФДТ свыше 1600 опухолевых узлов у 408 пациентов. Большинство больных ранее лечилось традиционными методами. Эти больные были пролечены методом ФДТ по поводу рецидивов и внутрикожных метастазов рака после хирургического, лучевого или комбинированного лечения. Часть больных ранее не получала лечения из-за тяжелой возрастной и сопутствующей патологии. И наконец, части больных проведена паллиативная ФДТ при распространенных обтурирующих раках пищевода, кардиального отдела желудка, трахеи, крупных бронхов, толстой кишки с целью реканализации стенозированного органа и улучшения качества жизни.

К настоящему времени накоплены данные динамического наблюдения в сроки от 2 месяцев до 9 лет. Положительный эффект ФДТ был отмечен у 94,4% больных, включая полную резорбцию опухолей в 56,2% и частичную - в 38,2% случаев.
     На данный момент этот новый перспективный метод лечения злокачественных новообразований с успехом используется в России, разрабатываются новые фотосенсибилизаторы и источники света для ФДТ и флюоресцентной диагностики опухолей. Для инициации интереса к этому новому, перспективному, недорогому методу лечения рака, а теперь уже можно смело сказать, и целого ряда неопухолевых заболеваний, необходимы тематические семинары и специальные школы для подготовки врачей.

      Литература

1. Amyles S. // JAMA. - 2001. - Vol. 285, № 18. - P. 2317-2318.
2. Stephenson J. // JAMA. - 2001. - Vol. 285, № 18. - P. 2318-2319.
3. Гельфонд Б.Р. // Инфекции и антимикробная терапия. - 2001. - Т.3, № 3. - С.3-4.
4. Яковлев С.В. // Инфекции и антимикробная терапия. - 2001. - Т. 3, № 3. - С. 6-7.
5. Wainwright M. // J. Antimicrob. Chemother. - 1998. - Vol. 42. - P. 13-28.
6. Zeina B., Greeman J., Purcell W., Das B. // Brit. J. Derm. - 2001. - № 144 (2). - P. 274-278.
7. Malik Z., Hanania J., Nitzan Y. // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. - 1990. - Vol. 5. - P. 281-293.
8. Bedvell J. et al. // The Lancet. - 1990. - Vol. 335, № 8700. - P. 1287.
9. Wolfsen H. et al. 57-th Annual Meeting American College of Gastroenterology // Miami Beach, 1992.
10. Bilski P., Ehrenshaft M., Daub M. et al. // Photochemistry and Photobiology. - 2000. - Vol. 71 (2). - P. 129-134.
11. Ferguson J. // Photochem. Photobiol. - 1995. - Vol. 62. - P. 954-958.
12. Schneider J., Quentin P., Floyd R. // Photochem. Photobiol. - 1999. - Vol. 70 (6). - P. 902-909.
13. Meyer-Betz F. Untersuchung uber die biologische (photodynamische) Wirkung des Hamatoporphyrins und anderer Derivate des Blut- und Gallenfarbstoffs // Dtsch. Arch. Klin. Med. - 1913. - Vol. 112. - P. 476-503.
14. Policard A. Etudes sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examines a la lumiere de Wood // CR Soc. Biol. - 1924. - Vol. 91. - P. 1423-1424.
15. Rasmussen D.S., Ward G.E., Figge F.H.J. Fluorescence of human lymphatic and cancer tissues following high doses of intravenous hematoporphyrin // Cancer. - 1955. - Vol. 1. - P. 78-81.
16. Schwartz S., Absolon K., Vermund H. Some relationships of porphyrins, X-rays and tumors // Bull. Minn. Univ. School Med. - 1955. - Vol. 27. - P. 7-13.
17. Lipson R.L., Baldes E.J., Olsen A.M. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection // J. Nat. Cancer Inst. 1961. - Vol. 26. P. 1-8.
18. Dougherty T.J. Studies on the structure of porphyrins contained in Photofrin II // Photochem. Photobiol. - 1987. - Vol. 46 (5). - P. 569.
19. Dougherty T.J. Photodynamic therapy - new approaches // Seminars in Surgical Oncology. - 1989. - Vol. 5. - P. 6-16.
20. Dougherty T.J., Thoma R.E., Boyle D., Weishaupt K.R. Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors: Role of the laser // Laser in Photomedicine and Photobiology R. Pratesi, C.A. Sacchi (eds). - New-York: Springer, 1980. - P. 67-75.
21. Kessel D., Thompson P., Musselman B., Chang C.K. Probing the structure of the tumor-localizing derivative of hematoporphyrin by reductive cleavage with LIAIH4 // Photochem. Photobiol. - 1987. - Vol. 46 (5). - P. 563.
22. Dougherty T.J., Kaufman J.E., Goldfarb A. Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors // Can. Res. - 1978. - Vol. 38. - P. 2628-2635.
23. Bugelski P.J., Porter C.W., Dougherty T.J. Autoradiographic distribution of hematoporphyrin derivative in normal and tumor tissue of the mouse // Cancer Res. - 1981. - Vol. 41. - P. 4606-4612.